分享通过ddPCR检测外泌体DNA和

发表期刊：Gastroenterology.

影响因子：19.

作者单位：1DepartmentofPathology,TheUniversityofTexasMDAndersonCancerCenter,Houston,Texas;TheUniversityofTexasMDAndersonCancerCenterUTHealthGraduateSchoolofBiomedicalSciences,Houston,Texas.

2DepartmentofPathology,TheUniversityofTexasMDAndersonCancerCenter,Houston,Texas;DepartmentofInternalMedicine,BiomedicalResearchInstitute,PusanNationalUniversityHospital,PusanNationalUniversitySchoolofMedicine,Busan,Korea.

3DepartmentofEpidemiology,TheUniversityofTexasMDAndersonCancerCenter,Houston,Texas.

4DepartmentofPathology,TheUniversityofTexasMDAndersonCancerCenter,Houston,Texas.

5DepartmentofPathology,TheUniversityofTexasMDAndersonCancerCenter,Houston,Texas;DepartmentofSurgicalOncology,TheUniversityofTexasMDAndersonCancerCenter,Houston,Texas.

6SheikhAhmedPancreaticCancerResearchCenter,TheUniversityofTexasMDAndersonCancerCenter,Houston,Texas.

7DepartmentofRadiationOncology,TheUniversityofTexasMDAndersonCancerCenter,Houston,Texas.

8DepartmentofGastrointestinalMedicalOncology,TheUniversityofTexasMDAndersonCancerCenter,Houston,Texas.

9DepartmentofSurgicalOncology,TheUniversityofTexasMDAndersonCancerCenter,Houston,Texas.

01

胰腺导管腺癌（pancreaticductaladenocarcinoma，PDAC）是癌症相关死亡的第三大原因，预计在未来10年内将上升为癌症死亡的第二大原因。尽管手术切除为PDAC提供了一种潜在的治疗选择，但只有少数患者（15%）被诊断为可接受手术治疗的疾病，即使在这部分患者中，5年总生存率（OS）仍低于30%。在可切除肿瘤患者中，新辅助治疗被越来越多地用于加强局部疾病控制。局部性和转移性疾病患者急需更有效的治疗分层和管理策略。基于血液的生物标志物（如循环DNA）可用于癌症诊断和治疗分层。

02

在本研究中，作者致力于研究使用配对的外泌体DNA（exoDNA）和胰腺癌循环肿瘤细胞DNA（ctDNA）作肿瘤监测（检测循环KRAS突变动态）在局部性和转移性PDAC患者中的临床应用，以确定它们如何以互补的方式用于预后和治疗分层，并与影像学和碳水化合物抗原（carbohydrateantigen，CA）19-9等标准疾病进展数据进行比较。

03

收集了例接受局部性或转移性胰腺腺癌治疗的患者的液体活检样本（在[基线]前和治疗期间采集了份血样）。从37例疾病对照个体收集额外的液体活检样本。使用ddPCR高灵敏度地检测血浆ctDNA和exoDNAKRAS突变等位基因比例（MAF），包括：G12V、G12D、G12R、G12C、G12S、G12A和G13D突变密码子。所有患者的中位随访时间为天。在纵向分析方面，作者分析了来自34例患者的个系列血样中的exoDNA和ctDNA。作者进行了包括Cox回归、Fisher精确检验和贝叶斯推理分析，将exoDNA和ctDNA中的KRASMAF与预后和预测结果联系起来。

04

基线初治疗状态下的ExoDNA和ctDNA检测显示，转移性疾病患者的KRAS突变检出率分别为61%和53%，局部性疾病患者的KRAS突变检出率分别为38%和34%（图1A和B）。当所有患者群体进行比较时，转移性疾病患者的循环突变KRAS等位基因比例（MAF）明显高于局部性疾病和胰腺囊肿患者（图1C）。在22例手术切除的原发性胰腺肿瘤中，手术切除组织和液体活检样本中exoDNA和ctDNA检测到的KRAS突变的符合率分别为95.5%和68.2%；而在12例穿刺样本中，符合率分别为83.3%和68.2%。

图1ddPCR检出率的韦恩图：检测例转移性疾病患者（A）和66例局部PDAC患者（B）配对的exoDNA和ctDNA，分析12/13密码子突变体KRAS。（C）通过ddPCR检测基线初治疗局部性和转移性疾病患者、胰腺囊肿和非肿瘤性胰腺疾病患者exoDNA和ctDNA中KRAS突变的MAF。与ctDNA相比，exoDNA中位MAF在转移性疾病患者中有显著性差异（P=0.05）；配对分析采用Wilcoxon检验。经Mann-Whitney检验，那些转移性疾病患者的exoDNA（P.）和ctDNA（P=.）的KRASMAF均高于局部性疾病患者。*P.05，**P.01，***P.，****P.。

05共34例局部性疾病PDAC患者在新辅助治疗期间进行了连续监测。在该队列中，完成新辅助治疗后，exoKRASMAF较基线水平的降低与手术切除显著相关，而对于未接受手术的患者，则相反（图2A和B）。具体来说，在接受了切除术的患者中，71%（12/17）的exoKRASMAF较基线治疗初期值下降，而在那些没有接受手术的患者中，17人中有16人（94%）的exoDNA的KRASMAF较基线状态增加或没有变化。然而，在ctDNA中未见KRASMAF变化与可切除手术之间的相关性。在34例可切除肿瘤的患者中，新辅助治疗后exoDNA水平的升高与疾病进展显著相关（P=0.），而ctDNA未显示与预后相关（图2B）。

图2（A）对CA19-9（蓝线）或基于放射学的RECIST1.1（黑线）检测不到进展的一个患者，进行新辅助放化疗前后的肿瘤监测。（B）exoDNA和ctDNA在新辅助治疗前后的MAF动力学显示exoDNAMAF升高或没有变化与进展有显著相关性（P=0.）。ctDNA检测未发现显著相关性。CA19-9与基线相比的变化也与疾病进展显著相关（P=0.）。

06

Kaplan-Meier分析，使用5%exoKRASMAF这一阈值，5%exoKRASMAF5%与无进展生存时间（PFS）和总生存率（OS）降低显著相关（图3A）。单因素分析显示，与ctDNA未检测到的患者相比，基线状态下有转移和可检测ctDNA的患者无进展生存时间（PFS）和总生存率（OS）明显较短（图3B）。多因素分析显示，exoDNA中MAF≥5%是PFS和OS的显著预测因子。多分析方法显示，在多变量分析中，在基线状态下检测的ctDNA和exoDNAMAF均≥5%是OS显著预测因子。

图3基于exoDNA测定的肿瘤负荷，基线初治患者的Kaplan-Meier曲线分层。（A）exoKRAS≥5%的患者PFS（中位数，71天vs天）和总生存期（中位数，天vs天）较差。ctDNA检测与较差的PFS（中位数，天vs天）和OS（中位数，天vs天）显著相关。

07

对血浆样本的纵向分析显示，在任何治疗前的exoDNA系列样本中，exoDNA中KRASMAF峰超过1%与最终的疾病进展（基于RECIST1.1放射学进展）显著相关（P.）（图4A）。

图4（A）使用连续液体活检监测肿瘤，显示exoKRAS峰≥1%（红线）与基于RECIST1.1的放射学进展（黑线）之间的相关性。

08

综上所述，在本项胰腺癌患者的前瞻性队列（包括转移性和局部性疾病）研究中，作者展示了如何通过ddPCR高灵敏度的检测exoDNA和ctDNA,进而对液体活检样本进行纵向监测，从而提供与治疗相关的预测和预后信息。

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